贴壁细胞是指在体外培养中附着在培养容器底部或壁上的细胞。当这些细胞生长到一定密度，或者为了进行其他实验时，就需要对其进行消化传代，胰蛋白酶在这个过程中扮演着关键的角色。今天小编就给大家盘点下它在贴壁细胞传代中的注意事项~

贴壁细胞的传代

细胞在培养瓶中长满后需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程也叫「传代」。当贴壁细胞处于对数生长期，且汇合度达到80%时，即可传代。

胰蛋白酶的作用原理

胰蛋白酶的酶切位点是肽链的Lys或Arg两个残基的羧基端肽链，通过在特定位置上降解蛋白，使细胞膜上与培养皿壁结合处蛋白降解，从而使两者分离。这时，细胞由于自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力可成为球形。

贴壁细胞传代中如何使用胰蛋白酶

胰蛋白酶在贴壁细胞传代的过程中被用来水解细胞外基质和细胞膜上的蛋白质，从而减弱细胞与培养容器或其他细胞的黏附力。下面是使用其进行贴壁细胞传代的一般步骤：

1.检查细胞状态：在进行传代前，首先要在显微镜下检查细胞的生长状态和密度，确保它们已经达到适宜传代的生长阶段。

2.清洗细胞：先将瓶中的培养基弃掉，并用生理盐水或1×PBS清洗2-3次，以最大限度地清除瓶内培养基的残留（培养基中所含的胎牛血清对胰蛋白酶的消化起抑制作用）。

3.加入胰蛋白酶溶液：加入少量消化液，盖过细胞即可。胰蛋白酶作用于赖氨酸或精氨酸的C末端，在37°C具有最佳的效率。将培养瓶放入温箱中处于37°C孵育（孵育的时间因细胞特性的变化而变化，并没有固定的时间），消化程度通过显微镜观察细胞的形态即可进行判断。

4.监控细胞分离：在显微镜下观察大部分细胞会皱缩变圆，此时则视为消化完毕；或者用移液器吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。如果发现消化不足，可加入胰蛋白酶消化液重新消化。

图1 贴壁细胞消化前（左）和消化后（右）

（图源于网络）

5.停止胰蛋白酶作用：一旦细胞分离，应立即加入含有血清的培养基来终止胰蛋白酶的消化作用，以防止消化过度对细胞造成不可逆损伤。使用重组胰蛋白酶则无需血清终止。

6.收集和分散细胞：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。将细胞悬液转移到离心管中，并通过离心来分离细胞。丢弃上清液，加培养液并用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

如何选择合适的胰蛋白酶

不同的细胞加入胰蛋白酶的成分和浓度不一样，不能一味的选择消化能力强的胰蛋白酶，否则会消化过度，损伤细胞。

贴壁不牢和半贴壁细胞：尽量使用浓度0.05%不含EDTA的胰蛋白酶且不需要放在培养箱孵育，这样易于控制，对细胞的伤害也降到最低。

贴壁性较强的细胞：需要使用含EDTA的0.25%的胰蛋白酶，消化细胞时间不宜过长。

在细胞培养中，EDTA常常用来螯合钙离子和镁离子，这对于阻断某些离子依赖性的细胞黏附过程非常重要。与胰蛋白酶一同使用，帮助分离贴壁细胞。

酚红在不同pH值下会呈现不同颜色，因此通过观察培养基的颜色，研究人员可以直观地判断培养环境的pH是否处于适宜细胞生长的范围。

重组胰蛋白酶具有与动物源性相同的酶学性质，但不含任何动物源成分，可替代胰蛋白酶使用，消化后可通过基础培养基或无血清培养基稀释降低活性，无需血清终止。之前发布的文章中提到过，重组胰蛋白酶无外源性病毒污染，而采用传统提取的酶可能存在支原体等污染，由于其酶蛋白活性不稳定，还会影响到细胞消化的结果。

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符合法规要求：生产设备和生产环境符合相关法规要求，生产过程遵循 ISO9001:2015 质量体系。

注意事项

1.为何细胞难以脱离培养瓶？

A：可能是胰蛋白酶活力不足或者使用的浓度较低，也可能是高汇合度和酶不能进入细胞基质的界面，以及未清洗的细胞内含有血清抑制了胰酶活性。可使用新鲜批次和最佳浓度的酶，或彻底清洗移除血清，或在低细胞浓度时解离细胞。

2.什么时候表示消化好了？

A：并不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才表示消化结束，一般肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙状移动就可以了，这时就应该停止消化。

——文中部分插图源自摄图网，已获授权